原代细胞的分离和提高纯度的优化方法方案)
外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）是指外周血液（即除骨髓以外的循环血液）中具有单个细胞核的一类免疫细胞的总称。它是免疫学、传染病、肿瘤及疫苗研发等领域最基础和重要的实验原料。犬外周血单核细胞的的分离纯化方案，采用经典密度梯度离心法以及提高纯度的优化方法方案。
图.全血组成以及各种组分的含量
对于大多数常规实验，经典的密度梯度离心法（Ficoll-Hypaque） 是首选，它通常包含以下步骤：
1. 核心步骤：Ficoll-Hypaque 密度梯度离心目前分离PBMC最经典、最常用的方法，其核心原理是利用不同细胞的密度差异进行分离。
Ficoll分离液：是一种密度约为 1.077 g/mL 的溶液，正好介于不同血细胞的密度之间。
分离过程：将抗凝血小心叠加在Ficoll分离液之上。离心后，红细胞和粒细胞因密度较高而沉至管底；血浆和血小板因密度较低而留在上层；而PBMC的密度与Ficoll液相近，因此会被“拦截”在血浆与分离液的界面上，形成一层白色的“白膜层”。
结果：通过吸取这层白膜，即可获得高纯度的PBMC。该方法分离的PBMC纯度可达 95% 以上，细胞活性（台盼蓝染色法检测）通常也高于 95%。
图.Ficoll 法分离犬PMBC示意图
详细分离步骤：
准备血液：使用EDTA或肝素钠的抗凝真空采血管采集新鲜犬外周血。血液采集后应尽快处理（如30分钟内），以保持细胞活性和状态。
稀释与铺层：将血液与无菌PBS按1:1的比例混合稀释。在离心管中先加入Ficoll分离液，然后将稀释后的血样小心地沿管壁缓慢叠加在其上层，注意保持清晰的界面。Ficoll与稀释后血液的体积比通常为1:1。
离心：在室温（18-22°C）下进行离心，关键的离心条件会因方案而异，几种有效条件如下：
900 × g，持续30分钟
500 × g，持续40分钟
700 × g，持续80分钟
收集与洗涤：离心后，可观察到液体分为数层，其中呈白膜状的PBMC层位于血浆层与Ficoll分离液之间。用移液管小心吸取该细胞层，转移至新离心管。加入PBS或细胞培养基（如含10% FBS的PBS）洗涤细胞，常用洗涤条件为 400 × g 离心10分钟，通常洗涤2次。
2. 提高纯度：优化方案一（三步法）
如果你的实验对细胞纯度要求极高，这个方案能显著提升效果。它的关键在于增加了一个“羰基铁吞噬”的预处理步骤来高效清除中性粒细胞。
第1步：羰基铁预处理：在稀释后的血液中加入10% (v/v) 的羰基铁粉与阿拉伯胶混合物，充分混匀后，在37°C下孵育30-60分钟。此步骤可让吞噬细胞（主要是中性粒细胞）吞噬羰基铁颗粒。
第2步：Ficoll密度梯度离心：将上述孵育后的血液小心铺在Ficoll分离液（密度1.079 g/cm³）上。完成离心步骤。
第3步：贴壁纯化：将离心后收集的PBMC重悬，放入预先用纤维蛋白原包被的培养瓶中，在37°C培养箱中静置孵育（通常1-2小时），进一步去除黏附能力强的单核细胞，富集淋巴细胞。
3. 细胞质量控制
分离完成后，务必对获得的细胞进行以下基础质量评估：
细胞数量：使用血球计数板计数，PBMC的得率会因个体差异而异。
细胞活力：分离后应立即检测。通常采用台盼蓝染色法，活力应>95% 为佳。
细胞纯度：通过流式细胞术或血涂片染色镜检评估，确保淋巴细胞比例符合实验要求。
4. 应用场景
分离到的犬PBMC是进行以下研究的基础：
免疫功能研究：用于淋巴细胞增殖实验（如ConA刺激）。
免疫细胞分选：可作为起始样本，通过磁珠分选进一步纯化特定免疫细胞亚群，如CD34+造血干细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）或CD14+单核细胞。
细胞治疗研究：作为种子细胞，用于体外扩增NK细胞等，进行肿瘤免疫治疗的临床前评估。
常见问题与解决方案
现象：获得的细胞层中红细胞污染严重。
主要原因：Ficoll分离液密度不匹配（犬的理想密度为1.079 g/cm³左右）或铺层时界面被破坏。解决方案：确认Ficoll密度，并重新仔细铺层。
现象1：血小板污染导致细胞聚团或实验背景高。
主要原因：血小板密度与PBMC接近，常规单次Ficoll离心难以完全去除。解决方案：采用“Ficoll + Percoll”两步离心法，即在Ficoll分离后，将收集的细胞再进行一次Percoll密度梯度离心，可有效去除血小板。
现象2：细胞得率远低于预期。
主要原因：离心条件不适宜（如离心力过大导致细胞破裂，或过小导致细胞未完全分离）。解决方案：优化离心参数，或检查抗凝剂是否使用正确（肝素抗凝常比EDTA效果更好）。
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