摘要
非靶向代谢组学是１种从生物组织或环境样品等复杂混合物中鉴定未知小分子（约≤2000 道尔顿）的强大方法。该技术能够在实验开始前未知多数化学物种的情况下，相对快速且经济地鉴定代谢物。这种情况在生物医学、环境研究中屡见不鲜，本文所述案例即为植物代谢物的发现。本文旨在提供以质谱法为检测手段的非靶向代谢组学实用技术知识，重点聚焦液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。为新手整合了１套标准化实验方案，作为实验设计、数据采集和数据分析的起点，并在实际实验和样品背景下解释相关术语与技术细节。除基础背景信息外，本文还提供了样品制备、液相色谱-串联质谱数据采集以及利用MSConvert、MZMine和SIRIUS等易获取且广泛使用的软件进行数据分析的分步方案。所选示例数据集基于具有不同化学性质的植物代谢物，但该方法本质上适用于几乎所有复杂生物样品。
#电喷雾电离 #液相色谱串联质谱 #质谱法 #植物代谢物 #非靶向代谢组学
基本方案 1：LC-MS/MS样品制备
图2样品制备方案可视化概述
(A) 新鲜采集的毛毡苔叶片（用镊子夹持）；
(B) 用无尘纸巾擦拭叶片，用去离子水清洗后拍干；
(C) 洁净叶片置于研钵中的液氮中；
(D) 研钵研磨后的叶片残渣；
(E) 研磨后的粉末与提取溶剂混合形成的叶片匀浆；
(F) 2 毫升离心管中的叶片匀浆；
(G) 高速离心后获得的叶片匀浆上清液；
(H) 用水性溶剂稀释后的叶片提取物；
(I) 最终液相色谱-质谱样品（即H中样品高速离心后的上清液）。
基本方案 2：LC-MS/MS数据采集
图1电喷雾电离与四极杆飞行时间（QTOF）离子路径示意图（未按比例绘制）
样品通过高压毛细管进入离子源腔室，经脱溶剂后快速聚集正电荷，形成带正电离子的气溶胶喷雾。这些离子通过离子光学系统导入质量分析器，离子光学系统吸引带电粒子垂直于喷雾方向移动，而不带电分子则被导向离子源腔室边缘并被移除。四极杆可作为质量过滤器，筛选特定质荷比（通常为 1.5 道尔顿）的离子而非允许所有离子通过，从而实现靶向串联质谱实验。在靶向串联质谱实验中，离子在碰撞池中发生碎裂，为复杂混合物中的特定分子生成清晰的串联质谱图。在非靶向数据非依赖性采集（如 MSe）中，所有离子同时碎裂，碎裂产物根据峰形和保留时间与特定母离子匹配。所有离子的质荷比通过飞行管测量，飞行管记录离子沿飞行路径到达检测器的时间。通过一系列已知标准品（包括甲酸钠簇、碘化钠或碘化铯）进行校准，可实现精确质量测量。
图8用于分离3种标准品（3-氯-4-甲氧基苯胺、咖啡因和N-月桂酰肌氨酸）的10分钟梯度总离子流色谱图
总离子流色谱图是液相色谱 - 质谱样品最简洁的呈现形式，它将单次扫描中所有离子的总强度与扫描相关时间作图。从左至右（蓝色矩形标注），可清晰观察到三种物质的 [M+H]⁺加合物对应的峰：3 - 氯 - 4 - 甲氧基苯胺（质荷比 = 158.0367，保留时间 = 1.09 分钟）、咖啡因（质荷比 = 195.0877，保留时间 = 3.05 分钟）和 N - 月桂酰肌氨酸（质荷比 = 272.2226，保留时间 = 5.30 分钟）。对于更接近实际的样品（尤其是梯度时间长且需分离多种分析物时），仅通过总离子流色谱图难以区分分析物的有用细节。
图910分钟色谱运行过程中乙腈比例（%B）变化的示例梯度（上图），用于分离3-氯-4-甲氧基苯胺、咖啡因和N-月桂酰肌氨酸
观察到 3 - 氯 - 4 - 甲氧基苯胺洗脱极早（1.07 分钟，0% B），随后是咖啡因（3.05 分钟，40% B），最后是 N - 月桂酰肌氨酸（5.30 分钟，86% B）。3 - 氯 - 4 - 甲氧基苯胺在等度洗脱阶段洗脱，此时仅含 0.1% 甲酸的水相流动相流经色谱柱，无乙腈。咖啡因在梯度从 0% 乙腈升至 100% 乙腈的过程中洗脱，约在 40% 乙腈时出现。根据流速不同，这意味着咖啡因最多需要 40% 乙腈即可开始沿色谱柱移动，但流速更快或梯度持续时间更长的条件能提供更准确的测量结果 —— 因为咖啡因可能在更低乙腈比例（如 35%）时开始沿色谱柱移动，但仅在洗脱后才能通过质谱仪检测到其存在。在使用快速色谱方法时，分析物开始沿色谱柱移动与洗脱后被质谱仪检测到之间的时间差是重要考量因素。
图10一系列质荷比对应的甲酸钠气相簇（[NaCO₂H]ₙNa⁺）的观测质量（上图谱图）与预期质量误差（下图图谱）校准曲线
上图谱图中质荷比 523.2 处的峰是无关污染物峰。随着簇尺寸和相应精确质量的增加，信号强度降低，这为使用甲酸钠簇进行精确校准设定了实际质量范围限制 —— 约 2000 道尔顿。碘化铯或碘化钾等替代校准品可用于更大质量范围，但它们以扩大质量范围为代价，降低了峰密度，导致特定范围内的校准点减少。聚乙二醇（PEG）等聚合物系列也可使用，但由于易形成多电荷物种而非更大的单电荷峰，其信号往往快速衰减。实际应用中，50-2000 道尔顿的质量范围可覆盖此类代谢组学实验中用户可能观察到的绝大多数单电荷和多电荷物种。更大的质量范围通常仅适用于高分子量、多电荷生物分子（如大型蛋白质或蛋白质复合物）。
图11LockMass标准品的使用与数据centroiding处理
Centroiding 处理基于质荷比和强度域中定义峰的点，计算峰的加权平均值（左竖线），即 “观测到的” LockMass 质荷比值；右竖线为 “预期的” LockMass 质荷比值，两者之间的水平距离即为校正值。。
图12咖啡因的 [M+H]⁺加合物观测同位素分布
质荷比 195.0888 道尔顿处的峰对应单同位素峰（也是基峰，丰度最高的峰）。与许多小分子一样，咖啡因表现出单调同位素模式，后续每个同位素峰（此处为质荷比 196.0904 和 197.0930 道尔顿处的峰）均低于前一个峰。
图133-氯-4-甲氧基苯胺（上图）、咖啡因（中图）和 N-月桂酰肌氨酸（下图）的碎裂谱图，采用10-100伏的碰撞能量梯度采集
基本方案 3：利用MSConvert、MZMine和SIRIUS软件进行数据分析
图3MSConvert 图形用户界面（GUI），显示适用于将原始数据文件转换为mzML文件的选项
针对含低能和高能通道且排除 LockMass 扫描的数据非依赖性采集 / 代谢组学实验，或每一次一级质谱扫描对应一次二级质谱扫描的快速数据依赖性采集实验
图4MZMine 4.6.1版本初始图形用户界面（深色模式，可在设置中切换）
左侧显示已加载的 mzML 文件，也可通过点击并拖动 mzML 文件至该区域完成加载
图5MZMine中的元数据窗口，显示按样品组（A、B或C）标记的mzML文件
图6含处理命令的MZMine批处理文件
图14SIRIUS图形用户界面（GUI）处理设置
评述
表1液相色谱-串联质谱实验故障排除指南
该表汇总了方案实施中的常见问题、可能原因及潜在解决方案
图7本文示例中使用的3种分子结构
从左至右依次为：1）3 - 氯 - 4 - 甲氧基苯胺（CMA）、2）咖啡因、3）N - 月桂酰肌氨酸（N-Laur），每种分子均标注名称、精确质量及其 [M+H]⁺加合物的质荷比值。
详细总结
思维导图（mindmap脑图）
实验方案详解（含3个基本方案+2个支持方案）
常见问题与解决方案
参考
Curr Protoc. 2025 Oct;5(10):e70232. doi: 10.1002/cpz1.70232. Design and Analysis of Untargeted Metabolomics Experiments
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